• 總有一種轉(zhuǎn)染方法適合你

  
  

一、

怎樣提高細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率?有的同學(xué)做了轉(zhuǎn)染，連接目的基因的載體帶熒光，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)在熒光顯微鏡下觀察，卻發(fā)現(xiàn)只有約百分之15左右的熒光，問(wèn)該怎么提高轉(zhuǎn)染效率?有沒(méi)有必要接著往下做篩選?還是重新轉(zhuǎn)染一次?

1、

如果要是做穩(wěn)定篩選的話，15%的轉(zhuǎn)染率應(yīng)該夠了。

提高轉(zhuǎn)染效率的話，可以適當(dāng)降低轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞的密度(我試過(guò)60～70%的密度比90%更好一些)，另外還有可能就是細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，還有在接種后24h內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

2、

轉(zhuǎn)染應(yīng)該在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)進(jìn)行才能保證轉(zhuǎn)染效率，因?yàn)樵摃r(shí)期細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，容易吸收外源質(zhì)粒，而不同細(xì)胞株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期是有差異的，因此建議先繪制培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線、確定其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后再著手做轉(zhuǎn)染。

二、

有同學(xué)用293細(xì)胞包裝病毒，轉(zhuǎn)染有熒光(約百分之二十)，但是感染總是沒(méi)有熒光，感染細(xì)胞狀態(tài)很好，第四天后開始變圓脫落。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞沒(méi)有抗性，不能篩。

1、

20%的轉(zhuǎn)染率太低了，一般用293T包裝慢病毒轉(zhuǎn)染率達(dá)到80%以上.轉(zhuǎn)染率太低和293T的代數(shù)有關(guān)系，還和質(zhì)粒的濃度和純度有關(guān)系。

2、

轉(zhuǎn)染的前一天將細(xì)胞傳代，根據(jù)你的細(xì)胞生長(zhǎng)速度，傳成適當(dāng)?shù)拿芏?，保證第二天細(xì)胞達(dá)到70%左右，做轉(zhuǎn)染。有的人用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，由于脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞有毒性作用，細(xì)胞特別容易脫落，所以防止細(xì)胞脫落，是提高轉(zhuǎn)染效率的關(guān)鍵。

3、

轉(zhuǎn)染的效率根本上還是由細(xì)胞種類決定的，有些細(xì)胞系好轉(zhuǎn)，效率高，有些就不怎么好了。但是我們還是可以盡可能的提高轉(zhuǎn)染效率，之前提過(guò)，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)要好，這個(gè)很重要。另外，每種細(xì)胞系都有自己的最好用的轉(zhuǎn)染試劑，要多看文獻(xiàn)知道這種細(xì)胞系用哪種轉(zhuǎn)染試劑最多。然后自己可以按照DNA和轉(zhuǎn)染試劑的比例做個(gè)曲線，看看reporter的表達(dá)效率，做到好的轉(zhuǎn)染效率。其實(shí)DNA的質(zhì)量也很重要，不僅僅是內(nèi)毒素影響細(xì)胞的生存，一般情況下DNA超螺旋最好比列越高越好。為了促進(jìn)表達(dá)，轉(zhuǎn)染前線性化也可以。

如果有些細(xì)胞系確實(shí)難轉(zhuǎn)，就應(yīng)該考慮其他方法了，電穿，病毒之類的。amaxa的nucleofector可以直接把質(zhì)粒打到核里，很好用。

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